|
|
Zjišťování struktury pórotvorných kolicinů
Riedlová, Kamila ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Barvík, Ivan (oponent)
5 Abstrakt Cílem této práce bylo prozkoumat chování jednotlivých helixů z C-terminální pórotvorné domény (CTD) kolicinu U v lipidové membráně na atomární úrovni. K tomuto účelu byla využita metoda all-atom molekulových simulací (MD). Posléze byla práce rozšířena i na CTD publikovaných struktur dalších pórotvorných kolicinů. Na jejím základě se podařilo identifikovat u samostatných helixů H1 a H10 jejich schopnost narušit integritu lipidové membrány. Přičemž u helixu H1 po jeho provedené organické syntéze byla jeho aktivita experimentálně ověřena pomocí metody BLM. Ostatní helixy jsou většinou velmi krátké na to, aby se udržely samostatně napříč v membráně a jejich chování může být ještě více ovlivněné nepřirozenými konci, proto již syntetizovány nebyly. Z MD simulací dvojic po sobě jdoucích helixů vyplynulo, že jejich struktura nebo schopnost udržet se v membráně může velmi záviset na blízkých interakčních partnerech. Výsledky této práce odhalují důležitost helixu H10 CTD kolicinů pro stavbu póru, která se do této chvíle vůbec neuvažovala. Také podporují toroidní model stavby póru navržený pro kolicin E1. Z výsledků této práce vyplývá, že koliciny, tyto unikátní proteiny schopné výskytu v roztoku i v lipidové membráně, obsahují aminokyselinové sekvence s určitými sekundární strukturami, které jsou i jako...
|
|
|
Studium vlastností minoritních strukturních proteinů myšího polyomaviru
Bílková, Eva ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent)
Myší polyomavirus (MPyV) je jedním z modelových zástupců čeledi Polyomaviridae. Kapsida MPyV se skládá z hlavního kapsidového proteinu VP1 a minoritních proteinů VP2 a VP3. Minoritní kapsidové proteiny pravděpodobně napomáhají přesunu virového genomu přes membránu endoplasmatického retikula na cestě do jádra v časné fázi infekce. Přesný mechanismus však není znám. Pro studium interakce proteinů VP2 a VP3 MPyV s membránou byly v minulosti vytvořeny expresní plasmidy, kódující mutované VP2 nebo VP3 fúzované s EGFP. Tyto proteiny mají delece v předpokládaných hydrofobních doménách. V této práci byla sledována lokalizace mutovaných proteinů v buňkách. Ukázalo se, že pro asociaci VP2 a VP3 s membránou je nejdůležitější hydrofobní doména 2, zatímco domény 1 a 3 jsou spíše postradatelné. Studium VP2 a VP3 pokračovalo dále analýzou charakteru jejich isoforem. Byly separovány isoformy obou proteinů o různé elektroforetické mobilitě pomocí SDS-PAGE. Následná analýza hmotnostní spektrometrií ukázala, že tyto isoformy se liší v důsledku deamidace na asparaginu společném oběma proteinům (pozice 253 pro VP2 a 137 pro VP3). V minulosti byla také identifikována acetylace N-koncového alaninu VP3. Pro studium funkce nalezených modifikací byly vytvořeny mutované viry se substitucemi těchto aminokyselin. Pilotní...
|
|
|
The study of model membrane systems, proteins and protein-membrane interactions using various fluorescence techniques
Štefl, Martin ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent) ; Plášek, Jaromír (oponent)
Membránové rafty (také často uváděny jako nanodomény) jsou membránové struktury, které jsou zodpovědné za spoustu buněčných procesů. Jejich charakterizace je velice složitá, protože nanodomény jsou opticky průhledné, jejich velikost je pod rozlišením optických mikroskopů a dynamika je veliká. Navíc vysoká různorodost buněk ještě více komplikuje jejich studium. Pro zjednodušení buněk jsou velice často používány membránové modelové systémy jako obrovské unilamelární vezikuly (GUVs) nebo podporované fosfolipidové dvojvrstvy (SPBs). V mé disertační práci byly vyvinuty, testovány a vylepšovány různé fluorescenční techniky ke studiu těchto membránových domén v modelových systémech. Fázorová analýza, metoda pro analýzu dat dob dohasínání fluorescence, byla teoreticky a experimentálně testována a následně použita k charakterizaci membránových nanodomén v GUVs. Nejdříve jsme využili fázorovou analýzu v lipidových vezikulech ke studiu procesů excitovaných stavů, jako je jev relaxace rozpouštědla a Försterův rezonanční přenos energie (FRET). Dále jsme aplikovali fázorovou analýzu k charakterizaci interakcí mezi proteiny a ligandy, ke studiu sbalování a denaturace proteinů. Nakonec jsme použili fázorovou analýzu dat z FRET v kombinaci s fluorescenční korelační spektroskopií (FCS) k charakterizaci membránových...
|
host ::
RSS.